牙膏抑制牙菌斑功效体外试验，是指脱离人体口腔的真实环境，在实验室可控条件下，模拟牙菌斑形成的相关场景，通过检测牙膏或其提取物对牙菌斑优势致病菌的生长、代谢，以及牙菌斑生物膜的形成、成熟过程的抑制作用，来评估牙膏抑菌活性的一类试验方法。

　　牙膏抑制牙菌斑功效评价检测中的体外试验不涉及人体受试者，核心目的是快速筛选牙膏配方、验证抗菌成分的作用靶点、明确抑菌的初步机制，为后续的体内临床试验（人体口腔试验）提供依据，减少体内试验的盲目性和成本。

　　牙膏抑制牙菌斑功效体外试验方法流程

　　1.细菌生长抑制试验

　　此方法用于检测牙膏对游离态牙菌斑致病菌的直接杀灭或生长抑制能力，常用肉汤稀释法和平板涂布法。

　　肉汤稀释法流程

　　在无菌96孔板中，加入定量的液体培养基和不同浓度梯度的牙膏混悬液。

　　接入对数生长期的试验菌液，使体系中细菌浓度达到10⁵~10⁶CFU/mL。

　　将96孔板置于37℃恒温培养箱中，厌氧培养18~24小时（模拟口腔厌氧环境）。

　　培养结束后，用酶标仪检测各孔的吸光度（OD值），OD值越低，说明细菌生长抑制效果越好；同时计算最低抑菌浓度（MIC）——即能完全抑制细菌生长的最低牙膏浓度。

　　平板涂布法流程

　　制备含不同浓度牙膏混悬液的固体培养基平板，同时设置空白培养基平板作为对照。

　　取定量菌液均匀涂布在平板表面，厌氧培养18~24小时。

　　培养后观察平板上的菌落数，计算菌落形成单位（CFU），通过与对照组对比，得出不同浓度牙膏的细菌抑制率。

　　2.牙菌斑生物膜抑制试验

　　牙菌斑在牙面以生物膜形式存在，此方法更贴近实际情况，常用羟基磷灰石片模型。

　　将羟基磷灰石（HA）片消毒后，放入含有液体培养基和菌液的培养皿中，37℃厌氧培养24小时，使细菌在HA片表面形成初始生物膜。

　　移除原有培养基，加入含不同浓度牙膏混悬液的新鲜培养基，继续厌氧培养24~48小时。

　　培养结束后，取出HA片，用PBS轻轻冲洗去除未黏附的细菌。

　　指标检测

　　活菌计数：将HA片上的生物膜超声洗脱，稀释后涂布平板，计算CFU，评估牙膏对生物膜内活菌的抑制效果。

　　生物膜形态观察：通过扫描电子显微镜（SEM）观察HA片表面生物膜的结构，对比对照组，判断牙膏是否能破坏生物膜的完整性。

　　生物膜代谢产物检测：检测生物膜代谢产生的有机酸（如乳酸）含量，有机酸减少量可反映牙膏对细菌代谢的抑制作用。

　　3.酶活性抑制试验

　　牙菌斑细菌会分泌葡糖基转移酶（GTF）等酶类，促进蔗糖转化为葡聚糖，进而加速生物膜形成。此方法用于检测牙膏对相关酶活性的抑制作用。

　　提取或制备目标酶液（如葡糖基转移酶）。

　　将酶液与不同浓度的牙膏混悬液混合，加入底物（如蔗糖），在适宜温度（37℃）下反应一定时间。

　　通过试剂盒或分光光度法检测反应体系中酶促反应产物的生成量，计算酶活性抑制率，判断牙膏是否通过抑制关键酶活性来阻碍牙菌斑形成。

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